Kleuren met methyleenblauw onder de microscoop: zo werkt het

Onder een microscoop zijn de meeste cellen bijna doorzichtig. Je ziet vage contouren, maar weinig details. Een kleurstof lost dat op. Methyleenblauw is daarvoor al sinds de negentiende eeuw een van de bekendste keuzes: goedkoop, snel en duidelijk. In dit artikel lees je waarom methyleenblauw zo goed kleurt, hoe een eenvoudige kleuring verloopt, wat je te zien krijgt en hoe je uit een 1% oplossing een kleuroplossing maakt. Een breder overzicht van het gebruik in het laboratorium en het aquarium vind je in Laboratorium, microscopie en aquarium.

Waarom methyleenblauw kleurt

Methyleenblauw is een basische kleurstof. Het molecuul draagt een positieve lading. In een cel zijn sommige onderdelen juist negatief geladen, vooral DNA in de celkern en RNA in de ribosomen. Tegengestelde ladingen trekken elkaar aan, dus methyleenblauw hecht zich daar het sterkst. Het resultaat is een cel met een donkerblauwe kern en een lichter blauw celvocht.

Bij bacteriën, die geen celkern hebben, kleurt de hele cel blauw. Daardoor steken ze scherp af tegen de achtergrond. Dat maakt methyleenblauw geschikt om snel te zien of er bacteriën in een monster zitten, en welke vorm ze hebben: bolletjes, staafjes of spiralen.

Hoe het molecuul is opgebouwd, en waarom het zo intens blauw is, lees je in Hoe werkt methyleenblauw?.

Een stukje geschiedenis

In de jaren 1880 gebruikten onderzoekers als Robert Koch en Paul Ehrlich methyleenblauw om bacteriën zichtbaar te maken, onder meer bij het onderzoek naar tuberculose. De Duitse arts Friedrich Loeffler ontwikkelde een kleuroplossing die nog steeds zijn naam draagt: methyleenblauw volgens Loeffler. Later werd methyleenblauw de basis van een hele familie bloedkleuringen, waarmee onder meer de malariaparasiet zichtbaar wordt. Krafts en collega's beschreven die geschiedenis in 2011. Meer in De geschiedenis van methyleenblauw.

Wat je nodig hebt

• Een microscoop, het liefst met een olie-immersielens voor bacteriën.
• Schone objectglaasjes en dekglaasjes.
• Een methyleenblauwoplossing, kant-en-klaar of verdund uit een 1% oplossing.
• Gedestilleerd water, een pipet en filtreerpapier.
• Handschoenen, een veiligheidsbril en een ondergrond die tegen vlekken kan.
• Voor het fixeren een vlam of warmteplaat, of methanol.

De eenvoudige kleuring stap voor stap

Een eenvoudige kleuring, of simpele kleuring, gebruikt één kleurstof. Zo verloopt ze in het laboratorium, volgens de technische gegevens van een kant-en-klare Loeffler-oplossing:

1. Uitstrijken. Breng een dunne laag van het monster aan op een schoon, vetvrij objectglaasje. Bij bacteriën uit een kweek meng je een klein beetje met een druppel water.
2. Drogen. Laat het uitstrijkje aan de lucht drogen.
3. Fixeren. Haal het glaasje een paar keer snel door een vlam of leg het kort op een warmteplaat. Zo hechten de cellen aan het glas en spoelen ze niet weg. In plaats van warmte kun je ook fixeren met methanol.
4. Kleuren. Bedek het uitstrijkje met de methyleenblauwoplossing en laat dat ongeveer een minuut staan. Sommige protocollen noemen een tot twee minuten.
5. Spoelen. Spoel voorzichtig met kraanwater of gedestilleerd water tot het spoelwater helder is.
6. Drogen. Dep het glaasje droog met filtreerpapier, niet wrijven.
7. Bekijken. Bekijk het preparaat eerst met een kleine vergroting en daarna met de olie-immersielens bij de hoogste vergroting.

Werk op een ondergrond die tegen vlekken kan, met handschoenen en een veiligheidsbril, en houd papier en alcohol uit de buurt van de vlam.

Wangslijmvlies: het klassieke schoolpracticum

Op school is het kleuren van wangslijmvliescellen een klassieker. Met de achterkant van een schoon wattenstaafje of een tandenstoker schraap je zachtjes langs de binnenkant van je wang. Dat materiaal smeer je uit in een druppel water op een objectglaasje. Je voegt een druppel verdunde methyleenblauwoplossing toe, legt er een dekglaasje op en zuigt overtollige vloeistof weg met filtreerpapier.

Onder de microscoop zie je platte, onregelmatige cellen met een duidelijke, donkerblauwe kern. Vaak zie je er ook kleine bolletjes en staafjes omheen: bacteriën die normaal in je mond leven.

Gistcellen: levend of dood?

Methyleenblauw wordt ook gebruikt om te zien hoeveel gistcellen in een monster nog leven, bijvoorbeeld bij het brouwen van bier of in onderzoek. Dat werkt via de redoxeigenschap van methyleenblauw. Levende cellen hebben enzymen die methyleenblauw omzetten in de kleurloze vorm. Ze blijven daardoor ongekleurd. Dode cellen kunnen dat niet meer en kleuren blauw.

Na een paar minuten tel je onder de microscoop de blauwe en de kleurloze cellen. Het percentage kleurloze cellen is een schatting van het aandeel levende cellen. Kwolek-Mirek en Zadrag-Tecza vergeleken in 2014 de methoden om levensvatbaarheid van gist te bepalen, met hun voor- en nadelen. Methyleenblauw is snel en goedkoop, maar minder nauwkeurig dan sommige nieuwere methoden, vooral als veel cellen beschadigd maar nog niet dood zijn.

Bacteriën met korrels

Bij sommige bacteriën kleurt methyleenblauw bepaalde korrels in de cel in een diepere tint dan de rest. Dat heet metachromasie. De korrels bestaan uit opgeslagen fosfaat. Bij de bacterie die difterie veroorzaakt, zijn ze zo kenmerkend dat laboratoria de kleuring volgens Loeffler gebruiken bij de herkenning. Daarnaast wordt methyleenblauw gebruikt als tegenkleuring in de kleuring volgens Ziehl-Neelsen, waarmee tuberculosebacteriën rood afsteken tegen een blauwe achtergrond.

In 1994 beschreven Misra en collega's dat de kleuring volgens Loeffler ook een goedkope en snelle manier is om de maagbacterie Helicobacter pylori in weefsel aan te tonen.

Een kleuroplossing maken uit een 1% oplossing

De klassieke oplossing volgens Loeffler bevat ongeveer 0,3 gram methyleenblauw op 30 ml alcohol en 100 ml gedestilleerd water. Dat komt neer op ongeveer 0,25%. Voor een eenvoudige kleuring hoeft het niet zo precies. Met een 1% oplossing kun je zelf een werkoplossing maken:

Gewenst	Mengen
Ongeveer 0,5%	1 deel 1% oplossing en 1 deel gedestilleerd water
Ongeveer 0,25%	1 deel 1% oplossing en 3 delen gedestilleerd water
Ongeveer 0,1%	1 deel 1% oplossing en 9 delen gedestilleerd water

Gebruik gedestilleerd water, schoon glaswerk en een flesje dat je duidelijk beschrijft met de concentratie en de datum. Bewaar een werkoplossing in het donker. Hoe je met concentraties rekent, lees je in 1% oplossing, 0,1% of poeder.

Veelgemaakte fouten

• Te dik uitgestreken. Cellen liggen op elkaar en je ziet geen details. Strijk dunner uit.
• Te lang gekleurd. Alles wordt donkerblauw. Kleur korter of verdun de oplossing.
• Te hard gespoeld. Het uitstrijkje spoelt weg. Spoel voorzichtig en fixeer goed.
• Niet goed gefixeerd. Zelfde probleem. Laat het glaasje eerst helemaal drogen voor je fixeert.
• Neerslag op het glaasje. Oude of ingedampte oplossing kan kristallen vormen. Filtreer de oplossing of maak een nieuwe.

Vlekken en opruimen

Methyleenblauw kleurt alles wat het raakt: huid, kleding, werkbladen en gootstenen. Werk daarom op een vaste plek met een afneembare ondergrond, met handschoenen. Restanten van een kleuroplossing giet je niet in grote hoeveelheden door de gootsteen. Tips voor vlekken en opruimen staan in Bewaren en vlekken.

Samengevat

Methyleenblauw kleurt onder de microscoop vooral negatief geladen onderdelen van de cel, zoals DNA en RNA, en maakt zo celkernen en bacteriën goed zichtbaar. Een eenvoudige kleuring bestaat uit uitstrijken, drogen, fixeren, ongeveer een minuut kleuren, spoelen en drogen. De klassieke oplossing volgens Loeffler bevat ongeveer 0,25% methyleenblauw, en die maak je uit een 1% oplossing door één deel met drie delen gedestilleerd water te mengen. In gistonderzoek onderscheidt methyleenblauw levende van dode cellen, en bij sommige bacteriën kleurt het kenmerkende korrels.